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本制品是一种基于离心式纯化柱法从PAGE胶中快速、便捷、稳定、高效、高质量地回收DNA片段的试剂盒。本试剂盒采用了一种新型的离子交换柱，在特定条件下，使DNA能在离心过柱的瞬间，结合到DNA纯化柱上，在一定条件下又能将DNA充分洗脱，从而实现DNA的快速纯化。无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，通常12个样品只需约20分钟即可完成。

本试剂盒可用于20～500bp的双链DNA (dsDNA)或20～500nt单链DNA (ssDNA)从变性或非变性PAGE胶中的回收和纯化。DNA片段大小会对回收效率产生影响，片段过大或过小，回收效率都会有所降低，DNA片段大小为40～100bp时，回收效率可达70%左右。本试剂盒纯化所得DNA可直接用于酶切、连接、PCR扩增、测序，PCR，杂交等后续实验。


聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)常用于小于1kb的DNA片段的分析和分离纯化。PAGE胶DNA电泳的最高分辨率可达1bp，因而广泛应用于寡核苷酸分离纯化，特别是引物的分离纯化，又称PAGE纯化。PAGE纯化也常用于高通量测序时PCR扩增产物的纯化。


本试剂盒回收DNA的操作流程如图1所示。含有目标DNA的PAGE胶经研磨、水浴浸泡渗透至扩散液、高速离心取上清、加入结合液吸附至纯化柱、两次洗涤、洗脱液洗脱等一系列步骤，最终得到高纯度的DNA片段回收产物。

图1.柱式PAGE胶DNA回收试剂盒操作流程示意图。

组分	规格
溶液I (扩散液)	32mL
溶液II (结合液)	38mL
溶液III (洗涤液)	63mL
洗脱液	5mL
纯化柱及废液收集管	50套
洗脱管	50个
塑料研磨杵	10个

保存：室温，有效期1年。

• 如果希望获得更高的回收效率，尽可能多地切除不含目标DNA的PAGE胶。
  
• 用研磨杵尽可能地把胶条磨碎，以促进后续DNA扩散、渗透至溶液中，最终提高回收效率。
  
• 试剂盒中的研磨杵需要重复使用。首次使用后，推荐清洗后使用核酸酶喷雾清除剂处理以确保去除核酸酶，然后再用蒸馏水冲洗后备用。
  
• 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
  
• 废液收集管在一次回收中需多次使用，切勿中途丢弃。
  
• 扩散液、结合液和洗涤液中含有乙醇，使用后须旋紧瓶盖以防挥发，并须按照易燃试剂的相关规范进行存放和使用。

• DNA变性/非变性PAGE电泳与切胶：
  
  • 根据所需分离纯化的DNA片段大小配制相应浓度PAGE胶，以达到最佳的有效分离效果，相关参数如下表所示。
    

    PAGE (%)	Size (bp)	Xylene Cyanol FF	Bromophenol blue
    3.5	100～2000	460	100
    5.0	80～500	260	65
    8.0	60～400	160	45
    12.0	40～200	70	20
    15.0	25～150	60	15
    20.0	6～100	45	12

  • 在DNA样品中按比例加入DNA上样缓冲液，混匀后上样。
    • 变性PAGE凝胶上样前请反复吹打上样孔，将沉淀的尿素吹出上样孔，以获得更好的电泳效果。
  • 接通电源，电泳至所需位置。
    
  • 取出PAGE胶，放置到含有NadRed等核酸染料的无DNA酶的水中，在侧摆摇床上缓慢摇动5～10分钟。
    
  • 使用一次性手术刀片将含目的DNA片段的PAGE胶切下，请确保切下的PAGE胶尽可能小并免受其它DNA片段的污染。
• 凝胶研磨：
  用本试剂盒提供的研磨杵在离心管内把PAGE胶研磨至细粉末状。
  
• DNA扩散：
  
  • 加入300μL溶液I至PAGE胶粉末中，适当混匀。
    
  • 55℃水浴60～90min，以促进胶中DNA扩散到溶液中。
    • 对于较大片段的目的DNA来说，可适当延长扩散时间，甚至37℃过夜，以提高回收效率。孵育过程中可以适当混匀几次，促进DNA的扩散。如果能使用带有震荡或摇动功能的恒温孵育装置效果更佳。
  • 13000g离心5分钟。
    
  • 小心吸取上清到新的离心管中，尽量避免吸取到凝胶。
    
  • 再次加入300μL溶液I至凝胶粉末中，55℃水浴30～60min，适当混匀。
    • 累计两次的扩散时间通常约2小时或以上就能获得较好的回收效果。扩散更长时间仅对长度明显偏长的DNA片段的回收效率提高有帮助。
  • 13000g离心5分钟。将上清液再次转移至步骤3d相同的上清液收集管中。
• 纯化柱吸附：
  
  • 向上清液中加入700μL溶液II，振荡或吹打混匀，室温放置1分钟。
    
  • 将混合液(包括沉淀物)分两次转移至纯化柱内，每次13000g离心30秒后倒弃收集管内液体。
    • 加入结合液后溶液总体积会超过纯化柱的容量(约700μL)，因此须分成2次过柱，即将一半的混合物(约650～700μL)加入纯化柱内后12000g离心30秒，倒弃收集管内液体，再将剩余的混合物加入纯化柱内12000g离心30秒，并倒弃收集管内液体。
• 洗涤：
  
  • 加入600μL溶液III，13000g离心30秒，倒弃收集管内液体。
    
  • 重复步骤5a一次。
• 洗脱：
  
  • 13000g离心2分钟，充分去除残留液体。
    
  • 将DNA纯化柱置于本试剂盒提供的洗脱管中，加入30～50μL洗脱液，室温放置2～3分钟。
    
  • 最高速(约12000～16000g)离心30秒，所得溶液即为经PAGE纯化的DNA。
    • 洗脱液需要加到纯化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20μL，但洗脱下来的总DNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次，可提高得率约10～30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量10～35%的DNA。

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